Komedia, określana przez ówczesną prasę jako pikantna farsa, składa się z trzech części: "Flirt", "Na maskaradzie" i "W hotelu". Bohaterką filmu jest piękna panna Bella, której wybranka nie aprobuje ojciec i wywozi dziewczynę do Warszawy. O rękę panny ubiega się jeszcze dwóch dużo starszych konkurentów i w związku z ich staraniami w tytułowym pokoju nr 100 rozgrywają się zabawne wydarzenia, przebieranki, bijatyki i nieustanne qui pro quo.

Kopia filmu została odnaleziona w Amsterdamie w 2000 roku przez krakowskich filmoznawców – Jerzego Maśnickiego i Kamila Stepana. Po obejrzeniu filmu powiedzieli: […] niektóre gagi nawet jeszcze śmieszą. […] A „rękoczyny”, których dopuszczają się w pewnej scenie aktorzy, rozwijają się w stylową bijatykę, prawie jak z wczesnych filmów Macka Senneta. Oczywiście wszystko się kończy dobrze i wesoło. Dla bohaterów „Tajemnicy pokoju nr 100” – bo wreszcie mogą się pobrać. Dla nas – bo mamy swój film.